DNA Sequenzierung: Kleine Übersicht

Viel wird / wurde ja über das Humangenomprojekt geredet und geschrieben und während das Humangenomprojekt (1990 gegründet) etwa 13 Jahre brauchte für ein Genom, kommt mittlerweile in immer kürzeren Intervallen neue hinzu.

Eine Liste dazu gibts u.a hier für Archea, Bacterien und Eukaryoten. Grundlage all dieser Projekte ist die Sequenzierung von DNA und da ich da Anfang 2010 erst einen Vortrag drüber hielt, will ich den euch mal nicht vorenthalten.

Zuerst einmal, was ist DNA-Sequenzierung und warum gabs das nicht früher?

DNA besteht aus den vier Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin, welche jeweils an den Zucker Desoxyribose geknüpft sind. Diese Nucleosid genannte Verbindung aus Desoxyzucker und Base wird dann über Phosphatgruppen mit anderen Nucleosiden verknüpft. Die DNA besteht aus einer Doppelhelix, was bedeutet, das ein DNA-Strang mit einem zweiten Strang verbunden ist über nichtkovalente Wechselwirkungen. Hierbei paaren sich immer die Basen Adenin (A) und Thymin (T), sowie die Basen Guanin (G) und Cytosin (C). Die DNA-Sequenzierung beschreibt die Analyse der Basensequenz der DNA.

Damit man diese Basenabfolge herauszufinden konnte, musste man zuerst Methoden entwickeln, um spezifisch nur eine Art von Base erkennbar zu machen, denn DNA ist zu klein um sie einfach unter ein Mikroskop zu legen. Ein weiteres Problem wenn man sehr kleine Dinge untersucht, man braucht oft sehr viel davon, um eine makroskopische Reaktion auf seine Untersuchung feststellen zu können.

In den 70ern gelang es DNA in Plasmide einzubauen und diese z.B. von E.coli vervielfältigen zu lassen.

Seit diesen Anfängen sind wir mittlerweile bei der dritten Generation von DNA-Sequenzierungsmethoden angelangt.

Die Unterschiede zwischen den Generationen sind hier schematisch dargestellt. Klassische Sequenzierung (Sanger) baut darauf auf die DNA ausreichend zu vermehren, dann zufällig unterbrochene Fragmente herzustellen und diese via Gelelektrophorese nach Größe zu trennen, so dass anschließend die Sequenz an Hand der Größenabfolge erkennbar ist. Next Generation Sequencing benötigt immernoch eine Vervielfältigung der DNA, die dabei in sogenannten Arrays organisiert wird. Danach werden stufenweise die verschiedenen Basen hinzugefügt, deren Einbau (oder nicht Einbau) in den komplementären Basenstrang meistens über Laserspektroskopie verfolgt wird. Am Ende wird dann über die Aneinanderreihung der einzelnen Signale die Sequenz zusammengesetzt. Third Generation Sequencing verzichtet dann auf die anfängliche Vermehrung der zu sequenzierenden DNA, sondern kann den Einbau einer Base direkt am komplimentären Strang beobachten, so dass am Ende lediglich die Sequenz zusammengesetzt werden muss.

Fangen wir nochmal am Anfang an. Eine der allersten Methoden war der chemische Abbau nach Maxam und Gilbert. Hierbei wurde nach ausreichender Vermehrung der DNA diese am 5' Ende des Strangs mit radiokativen Schwefel oder Phosphor markiert. Danach wurde die DNA in 4 Reaktionsbehältnisse aufgeteilt, in der jeweils eine Basenspezifische Reaktion angesetzt wurde, dabei wurden die Konzentrationen so gewählt, dass statistisch jeder Strang nur einmal gespalten wird. Bei diesen Reaktionen wurde neben Piperidin (ungesund und stinkt), auch Dimethylsulfat verwendet, ein sehr gutes Methylierungsmittel, dass allerdings ziemlich krebserregend ist. Am Ende wurden die Reaktionsmischungen mittels PAGE getrennt und die Banden durch schwärzen eines Röntgenfilms sichtbar gemacht.

Giftige Chemikalien und radioaktive Strahlung sind zwar beherschbar mit der nötigen Vorsicht, nichts desto trotz ist man immer froh darauf verzichten zu können. Und so hatte die Methode nach Sanger schonmal den Vorteil ohne giftige Chemikalien auszukommen. Auch hier fing man mit radioaktiv markierten Basensträngen an, die allerdings eine modifizierte PCR durchlaufen. Hier wird ebenfalls in 4 Teile aufgeteilt, wobei jeder Ansatz eine kleinere Menge von jeweils einem Didesoxynucleotid enthält, so wird bei der Vermehrung wieder statistisch einmal im Strang irgendwo die Synthese abgebrochen und es entstehen wieder Brüchstücke. Diese werden wieder mittels PAGE aufgetrennt und über einen geschwärzten Röntgenfilm kann man die Basensequenz ablesen.

Also im Prinzip: wenn es leuchtet, wurde etwas eingebaut. Man kann also die DNA befestigen, dann mit den verschiedenen Nucleotiden drüberwaschen und wenn etwas leuchtet, geht man davon aus, das entsprechende Base jetzt eingebaut wurde.

Um das ganze im großen Maßstab machen zu können, wird die DNA in kleinere Bruchstücke zerteilt, die wiederum an allgemeine Primer angesetzt wird. In einer Microemulsion-PCR können diese sich dann an komplementäre Primer auf der Oberfläche kleiner Kügelchen setzten, so dass diese praktissh mit einem Wald von gleichen DNA-Strängen 'bewachsen' ist.Die Kugeln werden dann Arrays versenkt, wo mit der oben erwähnten Methode dann die Sequenz ermittelt wird.

Bei der Third Generation wird wie erwähnt vorher keine DNA vervielfältigt, somit entfallen auch falsche Daten aufgrund von Kopierfehlern. Statt dessen hat man unterschiedliche Methoden entwickelt, die Basenabfolge direkt durch die Synthese eines komplementären Strangs zu beobachten. Eine Methode ist hier die Single Molecule Real Time Sequencing. Im Boden kleiner Vertiefungen ist hier jeweils eine DNA-Polymerase befestigt, an der der DNA-Strang repliziert wird. Das Beobachtungsvolumen ist dabei so klein, das das am Phosphor des Nucleotids gebundene Fluorophor nur detektiert werden kann, wenn die Base gerade in den Strang eingebaut wird.

Das beeindruckenste Beispiel für mich ist allerdings Ion Torrent. Auch hier haben wir eine immobilisierten DNA-Strang und wir waschen mit den verschiedenen Nucleotidlösungen über die Vertiefungen. Allerdings haben wir hier keine Fluorophore, sondern es wird direkt das beim Einbau freiwerdene Proton detektiert. Im Prinzip also nichts weiter als ein sehr empfindliches pH-Meter.

PS: Hier nochmal ein kleiner Vergleich von Ion Torrent (3rd Generation) mit 454, Illumina und SOLiD (alle drei next Generation)

Hier gefunden (von 2008).

 

Kleine Übersicht für Interessierte:

• Stein J., Automatische genetische Analytik, 1. Aufl., 1997, WileyVCH
• Brown T. A., Gene Cloning& DNA Analysis, 2010, 6. Auf., Wiley–Blackwell
• MardisE.R., Next-Generation DNA SequencingMethods, 2008, Annu. Rev. Genom. Human Genet., 9: 387-402.
• E. Pettersson et al., Generations ofsequencingtechnologies, 2009 , Genomics93: 105–111
• Rothberg J. M., LeamonJ., The development and impact of 454 sequencing 2008, 26: 1117-1124
• M.Delseny,etal., High throughputDNA sequencing: The newsequencingrevolution, 2010, Plant Sci., doi:10.1016/j.plantsci.2010.07.019
• Deckert R. & J., Recent advances in single-molecule sequencing, 2010, Current Opinion in Biotechnology, 21:4–11
• http://www.iontorrent.com/

 

Warum ich da drauf komme?

@fatmike182 hatte grad den Link gepostet: http://singularityhub.com/2011/03/05/costs-of-dna-sequencing-falling-fast-loo...

Wir sind jetzt bei 0,5 $ pro Megabase.

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